Mannheimia haemolytica growth and leukotoxin production for vaccine manufacturing: a bioprocess review

Mannheimia haemolytica leukotoxin (LKT) is a known cause of bovine respiratory disease (BRD) which results in severe economic losses in the cattle industry (up to USD 1 billion per year in the USA). Vaccines based on LKT offer the most promising measure to contain BRD outbreaks and are already commercially available. However, insufficient LKT yields, predominantly reflecting a lack of knowledge about the LKT expression process, remain a significant engineering problem and further bioprocess optimization is required to increase process efficiency. Most previous investigations have focused on LKT activity and cell growth, but neither of these parameters defines reliable criteria for the improvement of LKT yields. In this article, we review the most important process conditions and operational parameters (temperature, pH, substrate concentration, dissolved oxygen level, medium composition and the presence of metabolites) from a bioprocess engineering perspective, in order to maximize LKT yields.

A fast and simple assay to quantify bacterial leukotoxin activity

Background: Mannheimia haemolytica is the primary bacterial pathogen in causing bovine respiratory disease with tremendous annual losses in the cattle industry. The leukotoxin from M. haemolytica is the predominant virulence factor. Several leukotoxin activity assays are available but not standardized regarding sample preparation and cell line. Furthermore, these assays suffer from a high standard error, a prolonged time consumption and often complex sample pretreatments, which is important from the bioprocess engineering point of view. Results: Within this study, an activity assay based on the continuous cell line BL3.1 combined with a commercial available adenosine triphosphate viability assay kit was established. The leukotoxin activity was found to be strongly dependent on the sample preparation. Furthermore, the interfering effect of lipopolysaccharides in the sample could be successfully suppressed by adding polymyxin B. We reached a maximum relative P95 value of 14%, which is more than seven times lower compared to current available assays as well as a time reduction up to 88%. Conclusion: Ultimately, the established leukotoxin activity assay is simple, fast and has a high reproducibility. Critical parameters regarding the sample preparation were characterized and optimized making complex sample purification superfluous.

The pattern of distribution of pneumonic consolidation in experimental peste des petits ruminants virus (PPRV) and/or Mannheimia Hemolytica Infection in West African dwarf goats / Patrón de distribución de la consolidación pneumónica en infección experimental con virus peste des petits ruminants (PPRV) y/o mannheimia hemolítica en cabras enanas del Oeste Africano

The study into the pattern of distribution of the lung consolidation associated with common viral and bacterial pneumonia and their co-infection in subsaharan goats is scanty in literatures. Fifty apparently healthy West Africa Dwarf goats (WAD) six months of age were used for the experiment. The animals were divided into groups A, B, and C with 15 goats each while 5 goats served as control. Group A goats infected with 1ml of pure culture (1 X 109 CFU) of Mannheimia haemolytica MH A2, while group B with 1ml of pure cultured 106.5 TCID50 PPR virus grown in Baby hamster kidney cell lines and group C with 1 ml of PPRV and a week later 1ml of MH A2. The degree of consolidation or pneumonia as a percentage of the total lung volume was determined by visual observation, palpation and measurement of the lesion which is estimated as a percentage of each lobe. Student t-test were used to test for significant differences. The right lungs have a higher lung consolidation percentage than the left in all the treatment groups. The accessory lobe was affected in the PPRV group. The MH group has the highest lung consolidation percentage (10.1 percent). The PPRV 1-28dpi has the lowest consolidation percentage (1.06 percent). There is significant difference in the consolidation percentage and mortality between MH, PPR+MH, PPRV 28-45 dpi and PPRV 1-28dpi (P<0.05). This observation further show that the right lung and the anterior lobes were more affected in experimental viral and bacterial respiratory pathogen and their co-infection as the trachea birfucation is first to the right and the distance between the right and the left birfucation was 1.5 +/- 0.35cm. It is the first study that describes and compare the pattern of distribution and morphometry of pneumonia in experimental PPRV, MH and PPRV+MH infections in goats.

El estudio sobre el patrón de distribución de la consolidación pulmonar asociada con neumonía virales y bacterianas comunes y sus co-infección en cabras Subsaharianas, es escasa en la literatura. Cincuenta cabras enanas de África occidental (WAD) aparentemente sanas de seis meses de edad fueron utilizados para el experimento. Los animales se dividieron en grupos A, B y C con 15 cabras cada uno mientras que el 5 cabras sirvió como control. Grupo A cabras infectadas con 1 ml de cultivo puro (1 X 109 UFC) de Mannheimia haemolytica MH A2, mientras que el grupo B con 1 ml de cultivo puro 10 6,5 DICT50 PPR cultivado en líneas celulares de riñón de crías de hámsters y el grupo C con 1 ml de PPRV y un semana después de 1 ml de MH A2. El grado de consolidación o neumonía como porcentaje del volumen pulmonar total se determinó por observación visual, palpación y la medición de la lesión que se estima como un porcentaje de cada lóbulo. El test t de Student se utilizaron para probar las diferencias significativas. El pulmón derecho tiene un porcentaje de consolidación pulmonar superior a izquierdo en todos los grupos de tratamiento. El lóbulo accesorio se vio afectado en el grupo de PPRV. El grupo MH tiene el porcentaje más alto de consolidación pulmonar (10,1 por ciento). El PPRV 1-28dpi tiene el menor porcentaje de consolidación (1,06 por ciento). No hay diferencia significativa en el porcentaje de consolidación y la mortalidad entre MH, MH + PPR, PPRV 28-45 dpi y PPRV 1-28dpi (P <0,05). Esta observación muestra además que el pulmón derecho y los lóbulos anteriores se vieron más afectados en infecciones respiratorias patógenas experimentales con agentes virales y bacterianos y su co-infección como la bifurcación traqueal es primero a la derecha y la distancia entre la derecha y la bifurcación izquierda fue de 1,5 +/- 0,35 cm. Es el primer estudio que describe y compara el patrón de distribución y la morfometría de las neumonías en PPRV experimentales, MH y MH + PPRV...

Ocorrência de pneumonia associada à infecção por Mannheimia haemolytica em ovinos de Minas Gerais / Occurrence of pneumonia associated to infection by Mannheimia haemolytica in sheep of Minas Gerais

O trabalho descreve um surto de pneumonia em ovinos em uma propriedade na região central de Minas Gerais. Clinicamente os animais apresentavam apatia, mostravam dificuldade respiratória durante dois ou três dias ou morriam subitamente. À necropsia as alterações pulmonares eram similares em todos os ovinos. Havia consolidação dos lobos craniais e da parte ventral dos lobos caudais e ao corte fluía exsudato mucopurulento da traquéia e dos brônquios. No parênquima dos lobos craniais havia áreas brancas multifocais a coalescentes com 0,2-0,5cm de diâmetro, levemente proeminentes e intercaladas por áreas vermelho-escuras. Pleurite fibrinosa foi observada nos Ovinos 1, 2 e 3. As lesões de consolidação ocupavam cerca de 70-80 por cento da extensão pulmonar. Microscopicamente, as alterações eram de broncopneumonia fibrinopurulenta com intensa hiperemia, áreas com hemorragia intra-alveolar e espessamento dos septos interlobulares por inúmeros neutrófilos, restos celulares e intensa exsudação de fibrina. Áreas multifocais com necrose de liquefação contendo numerosas colônias bacterianas foram observadas no Ovino 3. Nos lobos craniais dos Ovinos 1, 2 e 3, haviam áreas com neutrófilos degenerados formando aglomerados de células alongadas com formato de "grãos de aveia" associados a colônias bacterianas. As alterações histológicas foram características de pneumonia causada por Mannheimia (M.) haemolytica. Amostras dos lobos craniais de todos os ovinos foram encaminhadas para cultivo bacteriológico e M. haemolytica foi isolada e identificada em todos os animais. Este é o primeiro relato correlacionando os achados patológicos e o isolamento de M. haemolytica como causa de broncopneumonia em ovinos no Brasil.

This paper describes an outbreak of pneumonia in a sheep herd in the central region of Minas Gerais, Brazil. Clinically, the animals presented apathy, exhibited respiratory difficulty during 2 to 3 days or sudden death. The animals were not medicated and found dead. Grossly, the pulmonary findings were similar in all sheep. The pulmonary cranial lobes and the ventral portion of caudal lobes were consolidated and purulent exsudate streamed out of the airways. In the parenchyma of the cranial lobes there were white slightly prominent multifocal to coalescent areas with 0.2 to 0.5cm in diameter intercalated with dark red areas. Consolidated lesions occupied 70 to 80 percent of the lungs. Fibrinous pleuritis was observed in sheep 1, 2 and 3. Microscopically, the findings were fibrinopurulent bronchopneumonia with intense hyperemia, areas with intra-alveolar hemorrhage and thickening of interlobular septa with numerous neutrophils, cellular rests and scattering fibrin. Multifocal areas with liquefaction necrosis containing numerous bacterial colonies were observed in sheep 1, 2 and 3. In the cranial lobes of these sheep, there were areas with degenerated neutrophils forming clusters of basophilic cells with alongated nuclei ("oat cells") associated with bacterial colonies. The histological findings were characteristic of pneumonia caused by Mannheimia (M.) haemolytica. Samples of the cranial lobes were sent for bacterial culture, and M. haemolytica was isolated and identified in all animals. This is the first report correlating pathological findings and the isolation of M. haemolytica as cause of bronchopneumonia in sheep in the country.

Caracterización de los procesos neumónicos en becerros lecheros de la región de Tijuana Baja California, México / Characterization of sairy calf pneumonia in Tijuana, Baja California, Mexico

Este estudio se realizó con objeto de caracterizar los procesos neumónicos sufridos por becerras lecheras de Tijuana, Baja California, México, así como conocer la importancia relativa de los principales agentes bacterianos involucrados. En 12 establos, con distintos tipos de alojamientos para sus crías, se obtuvieron muestras pulmonares de un total de 100 becerras, de 15 días a 4 meses de edad, con antecedentes de haber padecido neumonía. La mayor parte de los problemas neumónicos se presentaron en granjas que alojaron a sus crías dentro de edificios, mientras que las que utilizaban casetas exteriores mostraron el menor índice de mortalidad ocasionado por neumonías. Las muestras pulmonares fueron sembradas por duplicado en agar sangre y agar chocolate, e incubadas a 37oC por 24 h en aerobiosis o microaerobiosis, respectivamente. Las bacterias aisladas fueron identificadas de acuerdo a los métodos bioquímicos rutinarios, utilizando cepas de referencia como control. Se aisló Pasteurella multocida en 34 animales, P. haemolytica en 31 casos y Haemophilus somnus en 11 ocasiones. Además se aislaron diversas bacterias consideradas como secundarias: Streptococcus spp en 12 casos y Staphylococcus spp en 7 animales. La totalidad de las cepas aisladas de P. multocida fueron clasificadas como del biotipo A, al igual que las 31 cepas de P. haemolytica. De estas últimas, 26 cepas (83.9 por ciento) se clasificaron como serotipo 1 y solamente 2 cepas se caracterizaron como serotipo 2, detectándose 3 cepas no tipificables

Efecto de la inmunización pasiva sobre la reacción de Shwartzman en el pulmón del conejo empleando lipopolisacárido de Pasteurella haemolytica / The effect of passive immunization on the Shwartzman reaction in the lung of rabbits induced by Pasteurella haemolytica lipopolysaccharide

La reacción local de Shwartzman (RS) puede inducirse en el pulmón del conejo, empleando lipopolisacárido (LPS) de Pasteurella haemolytica. Se ha considerado que las lesiones provocadas por este fenómeno reflejan, al menos en parte, aquellas que se reconocen en casos naturales de pasteurelosis neumónica (PN) en el ganado. En este estudio se examinó la influencia de la inmunidad pasiva en el desarrollo de las lesiones pulmonares provocadas por la RS. Se emplearon dos grupo de conejos, el primer grupo recibió, por vía subcutánea, 4 ml de suero hiperinmune de conejo, preparado contra la cepa de P. haemolytica 82-25. El título de este suero contra el LPS de la bacteria fue de 1:2560, determinado por la prueba de hoaglutinación pasiva. El segundo grupo no recibió suero hiperinmune, sino solución salina fisiológica (SSF). Veinticuatro horas después, los grupos fueron subdivididos. La RS se provocó inoculando por vía endotraqueal 50 µg del LPS de la misma cepa de P. haemolytica y, 24 h más tarde, administrando 100 µg del mismo compuesto por vía endovenosa; a estos inóculos se les denominó preparatorio y desencadenante, respectivamente. Este procedimiento se realizó tanto en animales inmunizados como no inmunizados. Además, se incluyeron animales que recibieron solamente el inóculo preparatorio o el desencadenante. Todos los animales fueron sacrificados a las 36 h posinoculación; es decir, 60 h después de la inmunización pasiva y de la administración de SSF. Se emplearon secciones del pulmón derecho para observar los cambios patológicos, mientras que el pulmón izquierdo se empleó para realizar lavados bronquioalveolares (LBA) y determinar el número total de células y su conteo diferencial. Las lesiones reconocidas en los pulmones de los animales con RS fueron similares en severidad a las que se registraron en los conejos que recibieron únicamente la inoculación endotraqueal del LPS. Los animales que recibieron la inmunización pasiva presentaron una desproporción en las lesiones discretas, pero en otros, éstas fueron mucho más severas que en los animales no inmunizados. Estadísticamente, se identificaron diferencias entre los animales inmunizados y los no inmunizados en lo que concierne a número total de células y conteos diferenciales, siendo los valores mayores para los conejos inmunizados

Inducción de la reacción de Shwartzman en el pulmón del conejo mediante el empleo de lipopolisacárido de Pasteurella haemolytica / Induction of the Shwartzman reaction in the rabbit lung employing Pasteurella haemolytica lipopolysacharide

Se indujo la reacción de Shwartzman (RS) en el pulmón de conejo empleando lipopolisacárido (LPS) de Pasteurella haemolytica con el fin de comparar las lesiones provocadas con las que se presentan naturalmente en la pasteurelosis neumónica (PN). Para inducirla, primero se administró una dosis de LPS de Pasteurella haemolytica (50 mg) por vía endotraqueal (inoculación preparatoria) seguida 24 h más tarde por otra dosis del mismo LPS (100 mg) por vía endovenosa (inoculación desencadenante) (Grupo 5). Doce horas después, los animales fueron sacrificados. El pulmón derecho se destinó a estudios de histopatología, mientras que el izquierdo se empleó para realizar lavados bronquioalveolares (LBA). Para comparar se incluyeron grupos que recibieron solamente el LPS de P. haemolytica por vía endotraqueal (Grupo 3) o endovenosa (Grupo 4) (la inoculación faltante correspondió a solució salina fisiológica [SSF]), así como otro grupo al que se le administró LPS de Escherichia coli tal y como se describió al principio para inducir la RS (Grupo 2), y otro más que recibió SSF de la misma manera (Grupo 1). Las lesiones más notorias se presentaron en los animales que recibieron LPS de P. haemolytica por vía endotraqueal y en los que se les provocó la RS con el mismo LPS. Sólo los polimorfonucleares (PMN), monocitos y linfocitos recuperados por LBA resultaron diferentes entre los grupos, particularmente en los animales que recibieron el LPS de P. Haemolytica por vía endotraqueal y a los que se les indujo la RS con el mismo LPS. Se concluye que el LPS de P. Haemolytica es capaz de provocar una reacción flogística en el pulmón tanto por vía endotraqueal como endovenosa, aunque la respuesta es mucho más intensa en la primera, además, la RS no provoca una respuesta inflamatoria más intensa que la sola inoculación endotraqueal del LPS. Finalmente, se puede afirmar también que el conejo es un buen modelo para evaluar la respuesta inflamatoria pulmonar provocada por el LPS de P. haemolytica